ISOLASI DNA

Posted: November 20, 2009 in Kedokteran
Tags: , , , , ,

Waktu Percobaan        :           Rabu, 27 Oktober 2009

Tempat Percobaan       :           Laboratorium Histologi FK UNPAD

 

  1. Judul

Isolasi DNA

 

  1. Tujuan

Untuk lebih dapat mengenal DNA

 

  1. Prinsip

–          Merusak membran sel dan mengeluarkan DNA beserta organel lainnya ke dalam medium yang tidak dapat mendegradasi DNA.

–          Memisahkan DNA dengan protein histon.

–          Memisahkan DNA dengan komponen sel lainnya dengan pencucian

 

  1. Teori Penunjang

Dalam rekayasa genetika, isolasi DNA kromosom adalah tahap yang paling penting yang sering kali harus dilakukan. Hal ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk diklon. Adapun menurut Watson dan Crick struktur heliks ganda seperti DNA mempunyai ciri-ciri khas seperti tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang basanya berpasangan dengan ikatan hidrogen, dengan aturan perpasangan A-T dan G-C. Pasangan A-T diikat oleh dua ikatan hidrogen, sedangkan G-C oleh tiga ikatan hidrogen, perpasangan dengan ikatan hidrogen ini selain mengikat juga mempertahankan jarak antara dua basa. Antara dua utasan membentuk pasangan anti pararel yaitu antara kedua utasan terdapat arah yang berlawanan; ujung 5’P akan berhadapan dengan ujung 3’OH, antara dua pasangan basa terdapat jarak sebesar 3,4 A0. Dan pasangan dua utasan DNA membentuk suatu pilinan disekitar suatu sumbu dengan arah pilinan kekanan atau searah dengan arah jarum jam, setiap sepuluh pasang basa (3,4A0) akan membentuk satu pilinan atau perputaran 3600 yang berdiameter 200.

Proses merekristalisasi molekul DNA dengan menggunakan etanol dapat mengakibatkan terbentuknya endapan yang dapat dilakukan dengan cara mencelupkan batang pengaduk ke dalam larutan, maka molekul DNA akan terlilit pada batang pengaduk tersebut. Hasil isolasi DNA yang didapat dari percobaan ini adalah seperti benang-benang halus yang berwarna putih. Benang-benang tersebut merupakan kumpulan DNA yang berbentuk kromatin.
Kromatin terdiri dari sejumlah molekul DNA yang beruntai ganda yang sangat panjang dan massa protein dasar yang agak kecil serta hampir sama besarnya yang dinamakan histon disamping protein non histon dalam jumlah yang lebih sedikit (sebagian diantaranya bersifat asam dan berukuran lebih besar daripada histon) dan sejumlah kecil RNA. Heliks DNA berantai ganda dalam setiap kromosom memiliki panjang yang besarnya ribuan kali diameter nukleus sel. Salah satu tujuan molekul ini, khususnya histon adalah untuk memadatkan DNA.

 

  1. Alat dan Bahan
    1. Darah segar
    2. Antikoagulan EDTA
    3. Cell lysis solution
    4. RBC Lysis Solution
    5. Protein precipitation solution
    6. RNASe A
    7. Isopropanol
    8. Tabung ependorf
    9. Sentrifuge

10.  Mikropipet

11.  Waterbath

12.  Vertex

 

  1. Prosedur
    1. Menyiapkan darah segar yang telah diberikan antikoagulan EDTA.
    2. Menyiapkan tabung ependorf
    3. Memasukkan RBC lysis solution sebanyak 900 mikro liter ke dalam tabung ependorf
    4. Menambahkan darah segar sebanyak 300 mikro liter ke dalam tabung ependorf
    5. Melakukan proses Inverting
    6. Menginkubasi larutan tersebut selama 10 menit
    7. Melakukan proses sentrifugasi selama 30 detik dengan kecepatan 14.000 rpm
    8. Membuang supernatan dan mengambil benda darah yang mengendap
    9. Menambahkan Cell lysis solution sebanyak 300 mikro liter

10.  Menghomogenasi larutan dengan pengadukan menggunakan mikropipet

11.  Menambahkan 1,5 mikroliter RNAse A kedalam larutan

12.  Melakukan proses inverting

13.  Menginkubasi larutan tersebut selama 15 menit di dalam waterbath dengan suhu 37oC selama 15 menit

14.  Menambahkan protein precipitation solution sebanyak 100 mikro liter

15.  Melakukan proses sentrifugasi selama 3 menit hingga terlihat pellet yang berwarna coklat terang

16.  Menyiapkan tabung ependorf yangberisi isopropanol sebanyak 300 mikroliter

17.  Mengambil supernatant dan memindahkannya ke dalam tabung ependorf tersebut

18.  Melakukan proses Inverting hingga terlihat untaian DNA yang berwarna putih

 

  1. Hasil

Terlihat pita berwarna putih pada campuran supernatant dengan isopropanol

 

  1. Kesimpulan

Untaian DNA dapat diamati lebih lanjut karena telah dapat  dipisahkan dari protein histonnya.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s